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杂交瘤的克隆化和冻存

 

     克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中,可能会有数个甚至更多的克隆,可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞;所需要的抗体特异性抗体分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开,就需要克隆化。克隆化的原则是,对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化,否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制,因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快,二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆,以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失,从而丧失产生抗体的能力。

  一 克隆化方案

  用克隆化的方法很多,而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

  1. 有限稀释法的程序

  ① 制备饲养细胞悬液同融合前准备

  ② 阳性孔细胞的计数,并调细胞数在1~5×103/ml

  ③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个细胞/ml,100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个/ml,100μl/孔加D、E、F三排,为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5个/ml,100μl/孔,加G、H两排,为每孔0.5个细胞。

  ④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补加完全培养液200μl/孔。

  ⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测。

  注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

  2. 软琼脂法

  ① 软琼脂的配制

  含20%FCS小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640

  1%琼脂水溶液:高压灭菌,42℃预热。

  0.5%琼脂:由1份1%琼脂加1份含20%小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

  ② 用上述0.5%琼脂液含有饲养细胞15ml倾注于直径为9cm的平皿中,在室温中待凝固后作为基底层备用。

  ③ 按100/ml,500/ml或5000/ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

  ④ 1ml 0.5%琼脂液42℃预热在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。

  ⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上,在室温中10分钟,使其凝固,孵育于37℃,5%CO2孵箱中。

  ⑥ 4~5天后即可见针尖大小白色克隆,7~10天后,直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。

  ⑦ 检测抗体,扩大培养,必要时再克隆化。

 

  二 杂交瘤细胞的冻存

  及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候,细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存,则因为上述的意外而全功尽弃。

  杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样,原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上,但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变,在24孔培养板中培养,当长满孔底时,一孔就可以冻一支安瓿。

  细胞冻存液:

  50%小牛血清

  40%不完全培养液

  10% DMSO二甲亚砜

  冻存液最好预冷,操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃,再降温时一般按每分钟降温2~3℃,待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱,次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏,检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性,在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

  五、单克隆抗体的大量生产

  大量生产单克隆抗体的方法主要有两种:

  1. 体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞,从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低,一般培养液含量为10~60μg/ml,如果大量生产,费用较高。

  2. 体内接种杂交瘤细胞,制备腹水或血清。

  ① 实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1~3×107/ml接种于小鼠背部皮下,每处注射0.2 ml, 共2~4点。待肿瘤达到一定大小后一般10~20天则可采血,从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg/ml。但采血量有限。

  ② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane降植烷或液体石腊于BaLb/c鼠,1~2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞,接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获1~10ml腹水。也可用注射器抽取腹水,可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml, 这是目前最常用的方法,还可将腹水中细胞冻存起来,复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。