人皮肤成纤维细胞原代培养常用的成熟方法分为?优化贴壁法?和?酶消化法?两类，其中优化贴壁法操作更简便、细胞存活率更高，是目前更推荐的方案，以下是完整的标准化制作流程。
一、实验前置准备
试剂耗材
含10%胎牛血清的高糖DMEM完全培养基、0.05%胰蛋白酶、PBS缓冲液、75%酒精
眼科剪、镊子、6孔板、明胶包被液、无菌离心管
?样本处理?
新鲜无菌皮肤组织离体后立即放入预冷的含双抗的完全培养基中，2小时内送入超净台操作。
二、优化贴壁法操作步骤
皮肤组织用75%酒精浸泡5分钟，PBS反复漂洗3次，去除表面杂质。
修剪掉皮下脂肪和毛细血管，将皮肤剪成0.2cm×0.2cm的均匀小块。
提前30分钟用0.1%明胶包被6孔板，吸去多余明胶后每孔加入1mL完全培养基。
将皮肤组织块均匀铺在孔内，块间距保持0.3~0.5cm，放入37℃、5%CO?培养箱静置培养。
培养2天后镜下可见皮肤边缘长出类圆形高密度细胞层，第3天首次换液，每孔补加1mL新鲜培养基。
培养5~7天后用无菌镊子移去组织块，0.05%胰酶37℃消化3分钟，加入含血清培养基终止消化。
1000转/分钟离心5分钟，弃上清后用新鲜培养基重悬细胞，按1:3比例传代，即可获得纯化的人皮肤成纤维细胞。
三、酶消化法操作步骤
皮肤组织经酒精浸泡、PBS漂洗后，修剪掉皮下组织，表皮朝下平铺在培养皿中。
加入0.05%胰酶或5mg/mL分离酶，4℃条件下消化16~18小时。
用镊子揭去表皮层，将余下的真皮组织剪碎，加入1mg/mL I型胶原酶，37℃消化2~4小时。
待大部分细胞游离后，用无菌筛网过滤去除未消化的组织残渣，收集细胞悬液。
1000转/分钟离心5分钟，弃上清后用完全培养基重悬接种，放入培养箱培养即可。
四、细胞鉴定方法
镜下观察：传代后细胞呈细长梭形，汇合后呈栅栏状、漩涡状排列。
免疫荧光鉴定：对特异性表达的波形蛋白进行染色，阳性结果即可确认培养的是成纤维细胞。
