EB病毒转化的人B淋巴细胞处理方法

EB病毒转化的人B淋巴细胞处理方法:

1、首先，观察细胞培养瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象。若有，请拍照，并及时与技术支持联系（所拍照片将作为后续服务依据）。

2、用75%酒精擦拭细胞培养瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分贴壁细胞会有少量从瓶壁脱落；先不要打开培养瓶盖，将细胞置于细胞培养箱内静置培养2-4小时，以便稳定细胞状态。

3、仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如贴壁特性（贴壁/悬浮）、细胞形态、所用基础培养基、血清比例、所需细胞因子、传代比例、换液频率等。

4、静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照，记录细胞状态（所拍照片将作为后续服务依据）；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态。

5、贴壁细胞：若细胞生长密度超过80%，可正常传代；若未超过80%，移除细胞培养瓶内培养基，预留5ml左右继续培养，直至细胞密度达80%左右再进行传代操作，瓶盖可稍微拧松。

6、悬浮细胞：将细胞培养瓶内液体全部转移至50ml无菌离心管内，1200rpm离心5min，离心后上清培养基可收集备用，管底细胞沉淀加入5ml培养基吹打、重悬。镜检时，若细胞密度超过80%，可将细胞悬液分至2个细胞培养瓶内培养，补加培养基至5ml；若细胞密度未超过80%，将细胞悬液移至原瓶继续培养，直至细胞密度达80%左右时再进行传代操作。**续写内容：**

7. 传代操作注意事项：
- 贴壁细胞：吸弃旧培养基，用无菌PBS轻柔洗涤细胞1-2次，以去除残留血清和代谢废物。加入适量胰蛋白酶消化液（如0.25%胰酶-EDTA），覆盖瓶底即可，置于37℃培养箱内消化1-2分钟。显微镜下观察细胞回缩变圆后，轻拍瓶壁促使细胞脱落，立即加入含血清的培养基终止消化。吹打形成单细胞悬液后，按比例分装至新培养瓶，补足培养基。
- 悬浮细胞：若需扩大培养，可按1:2至1:3的比例分装，确保细胞密度适宜。传代时避免过度吹打，以免机械损伤细胞。

8. 冻存与复苏：
- 冻存：选择对数生长期的细胞，离心后重悬于预冷的冻存液（含10% DMSO和90%胎牛血清），分装至冻存管，标注细胞名称、代次及日期。采用程序降温盒或分步降温法（4℃ 30分钟→-20℃ 1小时→-80℃过夜），最后转移至液氮长期保存。
- 复苏：从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃水浴中摇晃至融化，用培养基稀释后离心去除DMSO，重悬接种至培养瓶，24小时后更换新鲜培养基以去除死细胞碎片。

9. 质量控制：
- 定期检测支原体污染（如PCR或Hoechst染色），确保细胞无菌。
- 观察细胞形态是否均一，若出现异常增殖或空泡化，需排查培养条件或重新保种。

10. 应用提示：
- EB病毒转化的B淋巴细胞可用于抗体生产、免疫学研究等实验，传代时建议保持密度在1×10^6/mL左右，避免过度稀释导致生长停滞。
- 若细胞状态不佳，可尝试调整血清浓度（如15%-20%）或添加IL-4等细胞因子增强活力。