在分离小鼠原代胃Cajal间质细胞（ICC）时，需特别注意以下操作细节以确保细胞活性和功能完整性：
1. 组织处理时效性
离体胃组织应在冰上预冷的PBS中快速转移至超净台，从处死小鼠到开始消化步骤尽量控制在15分钟内，避免缺血导致的细胞膜完整性损伤。若需暂存，可将胃组织置于4℃预充95%O?/5%CO?的Krebs缓冲液中，但不宜超过30分钟。
2. 酶解条件优化
推荐采用Ⅺ型胶原酶（1.5mg/ml）与分散酶（2.4U/ml）联合消化，37℃震荡水浴时间严格控制在25-30分钟。每10分钟轻柔吹打一次，镜下观察到组织呈絮状时应立即终止消化。过度消化会破坏ICC特有的突触结构，影响后续自发节律性检测。
3. 梯度离心纯化
采用Percoll非连续密度梯度离心（25%/40%）时，离心机需提前预冷至4℃，800g离心20分钟后，目标细胞主要分布于界面层。需注意吸管尖端需硅烷化处理，避免ICC因表面电荷特性而贴壁损失。
4. 培养条件控制
接种时使用经纤连蛋白包被的35mm玻底培养皿，培养基建议采用含SCF（20ng/ml）和胰岛素（5μg/ml）的DMEM/F12。培养箱需维持10%CO?环境，这对维持ICC膜电位稳定性至关重要。首次换液应在接种48小时后进行，避免扰动贴壁。
5. 功能验证节点
培养72小时后需进行c-Kit免疫荧光鉴定（建议使用Alexa Fluor 488标记的二抗），同步通过膜片钳检测典型起搏电流（如ANO1通道电流）。若发现自发节律异常，可尝试补充氯化血红素（50μM）恢复线粒体功能。
特别注意：操作全程需避光，因ICC对蓝光敏感；所有试剂需经0.1μm滤膜除菌，内毒素含量需＜0.01EU/ml。建议设立阳性对照组（如小肠ICC）以评估胃特异性ICC的分离效率。
?
